Onderzoek naar Fusarium poae: mycotoxinenpatroon, chemotypes en invloed van oxidatieve stress factoren

Promotor: Geert Haesaert
Copromotor: Kris Audenaert, Sarah De Saeger, Monica Höfte
Onderzoeker: Adriaan Vanheule

Periode: 08/2011-08/2015

‘Fusarium head blight’ (FHB) is een schimmelziekte die voorkomt op verschillende graangewassen, waaronder tarwe. Een belangrijke eigenschap van FHB is dat de ziekte veroorzaakt wordt door een mix van tot 17 verschillende species, die dezelfde symptomen veroorzaken. De interesse in FHB onderzoek vindt vooral een verklaring in de capaciteit van FHB fungi om mycotoxines te produceren. Dit zijn laag-moleculaire organische componenten die toxisch kunnen zijn voor mens en dier, en aldus een serieus gezondheidsrisico kunnen vormen.
Onderzoek aan de Hogeschool Gent bracht recent de steeds veranderende samenstelling van het Fusarium ziektecomplex in kaart. In Vlaanderen werd binnen dit complex een belangrijke plaats toegekend aan Fusarium poae. Tot recent werd aan deze soort weinig aandacht geschonken in het FHB onderzoek, aangezien andere types veel agressiever zijn. Het feit dat F. poae steeds meer voorkomt, dat het zich gedraagt als een secundaire aanvaller, en dat het mycotoxines kan produceren die veel toxischer zijn dan deze van andere species, illustreren de grote nood aan onderzoek op dit onderwerp.
Het Fusarium poae onderzoek aan de HoGent tracht de gaten in de kennis over dit organisme op te vullen. Veldisolaten die afkomstig zijn van verschillende testlocaties in België worden gekarakteriseerd aan de hand van een multidisciplinaire benadering met chromatografische, genetische en pathologische methoden. LC-MS/MS technieken worden gebruikt om het chemotype van de isolaten te bepalen. Het Fusarium poae project heeft hiertoe banden met de ‘Mytox’ Associatieonderzoeksgroep, en de chemotypering wordt uitgevoerd in het laboratorium Bromatologie aan de Faculteit voor Farmaceutische Wetenschappen van de Universiteit Gent. Productie van toxines wordt zowel kwalitatief als kwantitatief onderzocht onder verschillende condities en invloeden van stress zoals toediening van fungiciden.
Een verdere karakterisatie van de veldstalen omvat fungicide resistentie assays van F. poae en de gerelateerde species F. langsethiae tegen fungiciden zoals triazolen en strobilurines. Experimenten worden opgezet om de fysiologische effecten van de fungiciden op zowel een macroscopisch als een microscopisch niveau te onderzoeken. Deze benadering past in een groter geheel over oxidatieve stress als een trigger voor productie van toxines, wat een centraal dogma in toxine productie door alle toxigene fungi kan zijn. Om een bepaling van de agressiviteit van de isolaten uit te voeren, worden ‘detached leaf assays’ opgezet. Deze techniek laat ook toe F. poae te toetsen aan de verschillende soorten resistentie die voorkomen in tarwe. Opnieuw worden microscopische technieken gebruikt, nu om inzicht te verwerven in de infectiestrategie van het organisme. Het laatste stuk van de puzzel wordt ingevuld door aan de hand van AFLP-fingerprinting het genotype van de isolaten te onderzoeken.
Deze verschillende benaderingen van het steeds belangrijker wordende Fusarium poae vraagstuk laten ons toe een vrij volledig beeld op te hangen van de schimmel, en op deze manier de vraag naar kennis in de wetenschappelijke gemeenschap tegemoet te komen.

KORT OPLEIDINGSINITIATIEF

Het Kort Opleidingsinitiatief (KOI – VLIR-UOS) ‘intensive training on mycotoxin analysis’ met als promotor Prof. dr. apr. Sarah De Saeger is een intensief opleidingsprogramma specifiek gericht voor belanghebbende actoren uit ontwikkelingslanden. Deze 9-dagen durende training is gepland eind augustus of begin september 2012. Meer uitleg vindt u op de Engelstalige website.

MycoHunt: de ontwikkeling van een snelle biosensor voor de detectie van mycotoxines in tarwe

Promotor: Sarah De Saeger (coördinator UGENT), Mia Eeckhout (coördinator HOGENT)
Medewerkers: Yirong Guo (UGENT), Melanie Sanders (UGENT), Freya Martens (HOGENT)

Periode: 01/09/2010-31/08/2013

MycoHunt is een EU7de kaderproject dat zich richt op de ontwikkeling van een snelle biosensor voor de detectie van mycotoxines in tarwe.

Het project streeft naar het verhogen van de competitie van een grote groep van “kleine en middelgrote ondernemingen (SME)” in Europa door de ontwikkeling van een kosteneffectieve methode om de met deoxynivalenol (DON) gecontamineerde tarwe op te sporen.  Door de deelname van deze SMEs aan dit project, zullen deze veel nieuwe kennis verkrijgen en zal een nauwgezette methode voor staalname en detectie verkregen worden.

In het kader van dit project zal een toestel verkregen worden voor de staalname van stof of andere deeltjes met een laag moleculair gewicht. Hierbij zullen de optimale parameters zoals de temperatuur, druk, enz. vastgelegd worden voor het verkrijgen van stalen. Een ander aspect van dit onderzoek is de ontwikkeling van een specifieke sensor op basis van een immunoassay methode met DON specifieke monoclonale antilichamen. Kruisreactiviteit van deze antilichamen tegen andere trichothecenes zoals 3-ADON, 15-ADON moet vermeden worden. Bij deze immunoassay methode zullen verschillende immobiliserende methoden voor de DON specifieke monoclonale antilichamen bekeken worden.

The research leading to these results has received funding from the European Community’s Seventh Framework Program (FP7/2007-2013) under grant agreement n°243633.

Ontwikkeling en toepassing van molecularly imprinted polymers (MIP’s) in mycotoxine diagnostica

Promotoren: Nicolas Gryson & Peter Maene
Copromotoren: Sarah De Saeger & Peter Dubruel
Medewerkers: Frederic Dumoulin

Periode: 01/01/2009 – 31/12/2011
Grant: IWT-TETRA 080109

Fumonisin (FUM) is a mycotoxin that is mainly present in corn and derived products.
The presence of fumonisin in food and feed products may pose a risk to human and animal
health.

Current detection methods for fumonisins are based on the use of immuno-affinity columns.
Due to several disadvantages related to the development (use of laboratory animals, long development stage) and the use of these columns (high cost, single use), there is an increased demand for alternative user-friendly detection methods.
The goal of this research project is to develop a quick test for the detection of fumonisin in corn products with the aid of molecularly imprinted polymers (MIPs).

A first step involves the development and characterisation of the specific MIP. Main variables in this process are the choice of the functional monomer molecule, the cross-linker molecule and the porogeneous solvent used during
polymerisation. The characterisation basically implies the determination of the binding capacity.
In a second step, the procedure for fumonisin extraction from different corn products will be optimised, using a solid-phase extraction method. The optimised method should guarantee a recovery of 70 to 110 %.
Based on those two steps, a quick test for fumonisin detection will be developed. This is a semi-quantitative test based on fluorescence detection.
The developed test will be an adequate tool for food and feed companies for the auto control of samples, in order to comply with the current Belgian and European legislation on food and feed safety. The test will be fast, simple, cheap and user-friendly. It will therefore be a convenient tool for all stakeholders in the corn supply chain in the prevention of fumonisin contamination.

Onderzoek rond nieuwe analytische uitdagingen voor mycotoxinebepaling: Gemaskeerde (‘masked’) mycotoxinen

 

Promotor: Carlos Van Peteghem
Copromotoren: Sarah De Saeger, Dieter Deforce, Geert Haesaert, Mia Eeckhout
Medewerkers: Marthe De Boevre, José Diana Di Mavungu, Peter Maene
Periode: 01/08/2009 – 31/07/2013
Project nummer: BOF 05V00709, Associatieonderzoeksproject

Geconjugeerde mycotoxinen, waarbij het toxine gebonden is aan polaire substanties zoals suikers, worden gemaskeerde mycotoxinen genoemd, gezien deze aan de klassieke analytische technieken ontsnappen maar in de spijsvertering kunnen worden ontdaan van de geconjugeerde bindingen.
Tot op heden is slechts weinig geweten over het voorkomen van deze gebonden mycotoxinen in voedingsmiddelen.

Gekoppelde technieken zoals vloeistofchromatografie (LC) – tandem massaspectrometrie (MS/MS) bieden een krachtig hulpmiddel voor identificatie van substanties. Via hun moleculaire massa en fragmentatiegedrag kunnen mycotoxinen –gebruik makend van referentiestandaarden– geïdentificeerd worden. Met behulp van hoge-resolutie MS instrumenten, meer bepaald LC-quadrupool time-of-flight massaspectrometrie (LC-Q-ToF MS) en Fourier transform (FT) MS, is daarenboven de identificatie van onbekende schimmelmetabolieten mogelijk.

Doel van dit onderzoek is het nagaan van de mogelijkheden van LC-MS/MS en hoge-resolutie MS om de problematiek van gemaskeerde mycotoxinen aan te pakken. Via dit onderzoek zal een antwoord geformuleerd worden op volgende onderzoeksvragen:

•Welke mycotoxineconjugaten komen voor in graangebaseerd voedsel en voeder?

• Is het voorkomen van gebonden mycotoxinen in granen afhankelijk van de graanvariëteiten en genotypes (gevoelige vs. tolerante genotypes)?

•Wanneer en hoe komen de conjugaten voor?

•Wat is de verhouding tussen vrije en gebonden mycotoxinen?

•Spelen technologische factoren eenrol in het voorkomen van gebonden mycotoxinen?

• Is de waargenomen overschatting van mycotoxineconcentraties met ELISA kits in vergelijking met de klassieke LC methoden een gevolg van gemaskeerde mycotoxinen?

Beoordeling van de chemische risico’s van voedingsmiddelen die gemaskeerde Fusarium toxines bevatten

 

Coordinator: Sarah De Saeger
Copromotoren: Carlos Van Peteghem, Mia Eeckhout, Geert Haesaert, Kris Audenaert
Medewerkers: José Diana Di Mavungu, Marthe De Boevre, Peter Maene

Periode: 01/03/2010 – 31/02/2012
Project nummer: RT 09/3 MYCOMASK, FOD Volksgezondheit, Veiligheid van de Voedselketen en Leefmilieu

Gemaskeerde of geconjugeerde mycotoxinen trokken voor de eerste maal de aandacht in de jaren 80 omdat in sommige gevallen van mycotoxicose, de klinische observaties in dieren niet met de lage mycotoxineconcentraties in het overeenkomstige veevoeder correleerden. De onverwachte hoge toxiciteit werd daarom toegeschreven aan het voorkomen van niet gedetecteerde gebonden mycotoxinen die bij vertering door het dier wel terug werden vrijgesteld als de oorspronkelijke mycotoxinen.

De gemaskeerde mycotoxinen ontsnappen aan de klassieke analytische methodes door het feit dat ze door hun sterke polariteit moeilijker extraheerbaar zijn en dat ze voor een groot deel verloren gaan in de opzuiveringsstappen. Er bestaat erg weinig informatie met betrekking tot hun voorkomen en hun biodisponibiliteit.

Het project beoogt daarom de volgende objectieven:

1. Een betrouwbare extractie-, opzuiverings- en kwantificatiemethode op basis van vloeistofchromatografie tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS) op punt stellen voor de simultane bepaling van vrije en gemaskeerde Fusarium-toxinen in graan en graan-gebaseerde voedingmatrices;

2. Kwantitatieve data leveren over het voorkomen van gemaskeerde Fusarium-toxinen en de omstandigheden waarin deze worden gevormd, voornamelijk de geglycosyleerde metabolieten van deoxynivalenol (DON), zearalenone (ZEN) en T-2 toxine (T-2) in voedingsmiddelen;

3. De mate waarin dieren en consumentengroepen worden blootgesteld aan gemaskeerde mycotoxinen inschatten en een preliminaire risico-evaluatie uitvoeren.